Jessica Chang: Transforming gene discovery by radically open data sharing
A humán gének 51%-áról nem tudni, milyen hatással van a fenotípusra. Az újgenerációs szekvenálásoknak és a bioinformatika fejlődésének hála a felfedezések száma ugrasszerűen megnőtt. A következő 15 évben valószínűleg megugrik a feldolgozásra váró adatok mennyisége, de az elemzési, validálási kapacitás nem fog emelkedni, mert a kísérletek áteresztő képessége még mindig alacsony. Az adatok korai megosztása nem jellemző a kutatókra, mert mindenki magas impaktú lapba akar publikálni, ráadásul a páciens adatok nyilvánossá tétele etikai aggályokat is felvet. A megoldás a MyGene2 lenne, ahol a páciens oszthatja meg a saját vizsgálati adatait. Ez a Web2 alapokon nyugvó ötlet azért is előnyös, mert a kutatók a ritka betegségek kapcsán, ha megírták a publikációt, nem térnek vissza a betegekhez. Itt viszont a hasonló betegségben szenvedő páciensek kapcsolatban lehetnének egymással és információt kaphatnának az újabb terápiás lehetőségekről. Kórkép, fenotípus és a VCF feltölthető lesz, amit bárki nézegethet.
Konrad Karczenski: Prediction of splice variants and transcript-level effects improves the identification of gene-disrupting variants
A funkcionális régiókban a variációk száma lecsökken, de a szekvenálási hibák aránya ugyan az marad. Ha a variáció az intron kivágódás helyén keletkezik, az nem jelent feltétlenül a transzkript megszűnését, ha az intron tartalmaz GT vagy AG szakaszt az eredeti hely közelében, akkor a transzkript átíródhat. Ezen hibák felderítésére a Loftee VEP plug-in alkalmas. A Broad Institute Exac adatbázisa pedig összegyűjti ezeket. A potenciális kivágódási helyek megtalálására a MaxEstScan a legjobb program. A programból lesz új verzió is, amibe már integrált gépi tanulásos algoritmusok segítik a felhasználót.
Martin Kircher: Advancing massively parallel reporter assays for interpreting regulatory variants
A ritka variációk alacsony mintaszáma miatt nehéz szignifikáns eredményeket kihozni, ezért a megtalált variációk klinikai hatását a rcare nevű programmal lehet megbecsülni. A nem kódoló szakaszban előforduló variációk is fontosak, ezek felderítésére egy lenti vírus MPRA riporter assey-t kell használni. Ez beépül a genomba, de a beépülés helye nem lehet tetszőleges. A módszerük elég jól reprodukálható, de nem eléggé prediktív az eredmény, ezért a módszer további finomítására szorul.
Jennifer Harrow: Improving the speed of genome interpretation via network collaboration and knowledge sharing
Az Illumina felhő alapú genom elemző megoldása, a BaseSpace, több pipeline-t is tartalmaz. A szolgáltatáshoz tartozó AppStore-ban a felhasználó kiválasztja, milyen eszközökkel akar elemezni, majd fizet és megkapja az eredményeket. Nukleotid variációk keresésére még mindig a BWA+GATK a legjobb, struktúrális variációk felderítésére viszont a Delly-nél jobb a Manta. A megtalált variációk biológiai hatásának értelmezésére is van eszközük, ami állítólag 15 perc alatt lefut egy humán VCF-re. Ugyancsak van páciens fenotípus predikció is. A végső riport készítő alkalmazásuk pedig gyönyörű, publikáció kész összesítéseket bocsát a felhasználó rendelkezésére.
Jared Simpson: Analysis methods for nanopore sequencing data
Nanopore szekvenálás egy membrán két oldalán feszültség különbséget mér. A membránon keresztül vezet egy protein csatorna, amin ha átmegy a DNS, megváltoztatja a feszültséget. 1D-nek nevezik a kapott szekvenciát, ha egy szál halad csak át a csatornán, 2D, ha a reverz komplementer is átmegy. A szignál korrelál az átvándorló DNS mintázatával. Egy eseményből (frekvenia változás) 5 vagy 6 méretű k-mer szekvenciájára lehet következtetni (bár a homopolimer hiba magasabb 6-mernél). A hivatalos base caller a Metrichor, de a közösség létrehozta saját base callerjeit. A Nanocall egy rejtett Markov lánc alapú megoldás, csak úgy, mint a Metrichor, de a DeepNano már recurrent neurális hálózatot használ. A szekvenálás hatékonysága is sokat javult az új flowcelleknek hála. Az R7-nél még 81%, de az R9-nél már 92%, ami az új pólus fehérjének köszönhető. De novo összeszerelésnél hasznos eszköz a Nanopolish, ami egy rejtett Markov lánc alapú konszenzus készítő. Segítségével tovább csökkenthető a hibás nukleotidok száma. A szerkezet képes minden féle bonyolult könyvtárkészítési procedura nélkül metilált nukleotidok azonosítására. A base caller ebben az esetben kiterjesztett nukleotid készletet kap, hatékonysága 87% és a módszer hibája úgy tűnik kontextus függő.
Kerstin Howe: Curation of multiple genome assemblies of the same species and utilisation for reference improvement
Az előadó a GRC referencia genomok felügyeletétől jött. A referencia ellenőrzésére a gEVAL, Gbench programokat használják, de vannak saját curátor eszközök is. Az információt több helyről kapják. Vannak kapilláris szekvenálási eredmények, alternatív módon összeillesztett referenciák (például CHM1, HuRef embernél, MGSCv3 egérnél). Kérdés, mennyire jók a szekvenciák, mennyire lehet javítani a genomokat? Embernél az elsődleges cél a chr11 javítása, amihez optikai illesztést (optical mapping) és BAC klónokat, PacBio szekvenálásokat használnak. A kapott konszenzus szekvenciákat összehasonlítják. Meglepő módon még mindig vannak hiányzó és hiányos gének, mert a repetitív részeknél fragmentálódik a szekvencia. A kromoszómára nem illeszkedő részeket igyekeznek bevonni az összeszerelésbe, átrendezik a scaffoldokat, eltávolítják a lyukakat és hibás duplikátumokat. Munkájuknak hála 1300 problémát oldottak meg és 3%-al csökkentették az N-ek számát. Aki részletesebben is érdeklődik munkájuk iránt, nézze meg az oldalukat.
Frank Nothaft: Processing genomics data at scale with ADAM and Toil
A szekvenálás igen olcsóvá vált, de a számítógépek még nem tartanak ott, hogy lépést tartsanak az adat áradattal. A processzor mag szám növekszik, a I/O keresztmetszetét horizontálisan skálázódó eszközökkel igyekeznek növelni. A felhő sem jelent megoldást mindenre, mert a performancia sok esetben rosszabb, mint a HPC-k esetében. Egy lehetséges megoldás az Apache Spark. Ez a memória alapú adatbázis iteratív feladatokra a legjobb, erős Python/R/SQL támogatással. Hogyan lehet ezt genomi adat feldolgozásra használni? Először is más logika alapján kell szervezni a munkát, hogy jobban kihasználhassuk a párhuzamos feldolgozás adta előnyöket. A régi fájlformátumok (BAM/VCF) nem támogatják ezt a fajta feldolgozást, mert szekvenciális módon tárolják az információt, valamint az egymásra épülő feldolgozási lépések bizonyos feltételekkel hajtódnak csak végre (legyen a BAM sorba rendezve). Erre a Toil lehet a megoldás, ami egy munkafolyamat építő eszköz, Python alapokon. ADAM-al együtt használva 30-szor gyorsabb sebességet érhetünk el, miközben az eredmények nem változnak. Természetesen nem minden munkafolyamat ültethető át erre a logikára. Haplotípus azonosítás már nem skálázódik hasonló hatékonysággal.
Andrew Farrel: RUFUS: Reference free variant detection improves accuracy
A Rufus egy de-novo mutáció kereső program, ami illesztés nélkül találja meg az eltéréseket. Bemeneti adatai trió adatok. K-merekre bontja a readeket, hashbe gyűjti őket, majd de-novo assemblyt készít az egyedi szekvenciákból. Mivel csak a szekvenciákat nézi, minden élőlényen működik, nem szükséges paramétereket állítgatni. GATK-hoz nagyon hasonló eredményt ad ember esetén, de például a férfi X kromoszómán pontosabbak a találatok, mert a GATK feltételezi, hogy diploid szekvenciákkal dolgozik. https://github.com/jandrewrfarrell/RUFUS
Alicia Oshlack: SuperTranscript: a linear sequence assembled for the visualization and analysis of transcriptome data
Először a readeket összeszerelik a transzkriptekké, majd génekké klaszterezik őket a Corset nevű programmal. A kérdés, hogyan érdemes vizualizálni az egyes izoformákat? Ők úgynevezett szuper transzkripteket készítenek, ami minden lehetséges szekvenciát tartalmaz. Az így kapott mesterséges szekvencia akár differenciál expressziós vizsgálatokra is használható. Előnye, hogy könnyen áttekinthető az exon lefedettség, nem kell aggódni a több helyre illeszkedő readek miatt. A Lace nevű program képes a beadott klaszterekből szuper-transzkripteket építeni. Nem model organizmusokhoz is használható és akár variációk detektálására is használható. Az előadáson bemutatott egyik ROC görbe, ami az egyes transzkriptek expresszióját hasonlította össze, nem volt teljesen meggyőző, de egy másik példában olyan új csirke szekvenciát találtak, ami nincs benne a genomban. A hagyományos differenciál expresszióval való összehasonlítás eltérést mutat a két módszer között, de az előadó szerint a szuper-transzkript ennek ellenére is jobb módszer.
Jouni Siren: GCSA2: A scalable approarch to indexing population variation graphs
Hogyan indexeljünk útvonalakat gráfokban? Ez egy kompromisszum az index mérete, részletessége és a keresés hatékonysága között. A gráfok számítógépes reprezentálásá folyamatosan fejlődött. Először deBruijn gráfokat használtak, később ezt felváltotta az FM index. A legújabb adatstruktúra a GCSA2. A gráfoknak lehetnek redundáns algráfjai, amiket ha összevonunk, kisebb memória méretet érhetünk el. Egy LF térképezésnek nevezett eljárás segítségével hosszú, egzakt egyezéseket derítenek fel a gráfokban. Az implementáció az 1000 genom variációit 7 óra alatt 387 GB-ra tömöríti és 4 mikroszekundum alatt megtalálja a keresett szekvenciát. Sebességben a BWA szintjén jár.
Birte Kehr: Unknown and non-repetitive sequence in the Icelanders genomes
Az izlandi emberek szekvenálása során olyan szekvenciákra bukkantak, amelyek nincsenek benne a referencia genomban, nem repetitívek és nem transzpozonok. Tizenötezer ember genomjából a nem illeszkedő readeket kiszedték, kiszűrték a mikrobiális genomokat, a maradékot Velvet segítségével összeszerelték. Csoportokba rendezték a kontigokat és variációkat kerestek bennük. A fenotípus még nem teljesen beazonosított, de struktúrális variációkkal találtak asszociációkat.
Katie Pollard: Decoding enhancer function with machine learning
A távoli enhanszerek beazonosítása, a szabályozott gének megtalálása és az enhanszerek mutációinak hatásvizsgálatára gépi tanulási módszereket vetettek be. Sok esetben a Chip-seq nem az enhanszereket azonosítja, a peakhez legközelebbi gén nem minden esetben a szabályozott gén. A szabályozás ennél komplexebb. Az EnhancerFinder képes elkülöníteni az aktív enhanszereket, egy másik eszköz, a MotifDiverge segítségével pedig megállapítható, hogy a transzkripciós faktorban azonosított mutáció a funkció elvesztésével jár-e. Chip-seq adatok mellett publikus Hi-C adatokat is feldolgoztak és azt vették észre, hogy a peakhez közeli gének sok esetben nem szabályozottak. A TargetFinder segítségével a komplex interakciók is azonosíthatóak. Azt a hipotézist vették alapul, hogy ha mutáció keletkezik a szabályozó régióban, akkor az a DNS alakjának megváltozásával jár, mert a transzkripciós faktorok térbeli alakokat ismernek fel. DNAshape program 5mereket rendel struktúrálist formákhoz. Egy hipergeometrikus teszttel megnézték, hogy ezekhez a strukturális formákhoz lehet-e szekvenciát rendelni. A peakek 25%-hoz sikeresen rendeltek összetartozó térbeli formát és szekvenciát. Az eredményeket CRISPR/Cas rendszeren ellenőrzik.
Chris Probert: DeepNuc: A deep learning model that accurately predicts genome-wide nucleosome positioning from ATAC-seq
ATAC-seq-el a nyitott kromatin régiókat lehet meghatározni. V-plotot használnak az eredmények megtekintéséhez, de a nukleoszóma kötőhelyek megtalálása így is nagy kihívás. Nagy mélységű neurális hálót tanítanak be, ahol az első réteg egy konvolúciós mátrix, majd 6 rejtett réteget használnak és különböző szűrőket használnak a különböző jellemzők azonosítására. A kimenet a MNáz szignál. Az eredmények összehasonlításából az derül ki, hogy bár a random forest módszerek is egészen jó eredményeket adnak, az előadó módszere még annál is jobb, split-ATAC-seq-el egyenesen tökéletes.
Michael Hoffman: Transcription factor expression and its effects on binding site occupancy and motif preference
A transzkripciós faktor kötése sejtvonal függő, ezért RNA-seq-et és Chip-seq-et csináltak ugyan abból a szövetből, hogy meghatározzák a kötés preferenciáját. Azt találták, hogy a peakek erőssége korrelál a gén expresszióval. Azt is észrevették, hogy különböző motivumok más-más szövetekben aktívak. A motivumokat klaszterezése után azt találták, hogy a motivumok sejttípus függőek, de biológiai validálást még nem végeztek.
Anshul Kundaje: Deep learning transcription factor binding sites and regulatory sequence grammars in diverse cell types and lineages
A gépi tanuláson alapuló módszerükhöz a tréning adata az 1kb hosszú genomi régiók, amelyek átfednek a transzkripciós faktor peakekkel. A negatív adatszett azokat a régiókat tartalmazta, ahol nincs átfedés. Ha elég sok konvolúciós réteget halmoznak egymásra, motivum kombinációkat is képes megtalálni a rendszer. Habár különböző bemeneti adatokkal tanították a rendszert (ATAC-seq, MNase-seq), a rendszer nem tűnik elég kiforrottnak. Például a Homerrel történő összehasonlítás során az eredmények inkább az utóbbi felé hajlottak. Valószínűleg a negatív adatszettel lehetett valami probléma. Link, link.
Vera Kaiser: Mutational biases drive elevated rates of substitution at regulatory sites across cancer types
A nem kódoló variációkat nem kutatják olyan intenzíven. A transzkripciós adatbázisok átnézése közben azt vették észre, hogy kicsi az átfedés közöttük. Khi-négyzet probával összehasonlították a rákhoz köthető gének szabályozó régióit egy kontrol régióval, nézték a mutációs spektrumot és vizsgálták a variációkat. Azt vették észre, hogy a CTCF kötőhelyeknél a mutációk aránya eltolódott. Regressziós analízissel igyekeztek meghatározni, mely hatások a legjelentősebbek (pl. replikációs idő), de csak azt találták, hogy mindegyk fontos.
Kim Pruitt: NCBI graphical display tools – Hidden in plain sight
Az NCBI-nál egy új genom nézegetőt készítettek. Érdekessége a többi, hasonló kezdeményezéssel szemben, hogy ez tetszőleges weboldalba integrálható, majd saját annotációt lehet hozzárendelni. A terv az, hogy a GEO-ból is elérhető legyen. Bemutatták a Genome Workbench legújabb verzióját is, a tervek szerint ez fogja leváltani a SeqIn-t.
David Powell: RNA-seq visualization using Degust
A Degust, ahogy az előadás címe is mondja, egy kollaboráció központú RNA-seq vizualizációs program. Mivel az RNA-seq analízsre számtalan megoldás létezik, ezért ezeket építették be a Degustba és inkább a kutatók együttműködésére helyezték a hangsúlyt. Számtalan interaktív eszköz áll a kutatók rendelkezésére, hogy a differenciál expressziós eredményeket nézegessék. A bemenet egy nyers mátrix, amit webszerver alapú alkalmazás ezután feldolgoz. Magas szinten működik, de a hozzáértőknek lehetőségük van, hogy akár az ábrákat generáló R kódot is megtekintsék. A rendszert lehet az eredmények tárolására is használni. Érdekessége, hogy eredetileg Haskelben írták, de végül NodeJS-ben implementálták újra: https://degust.org
Jonathan Manning: ShinyNGS: Interactive data mining with R and Shiny
A Shiny egy webes keretrendszer R-hez, interaktív weboldalak készítéséhez. Ezen alapul a ShinyNGS, ami az analízis végén helyezkedik el és a már analizált eredmények megjelenítésével foglalkozik. Az előadásban példákat láttunk a használatára. A szerzők szeretnék kiterjeszteni egy sejtes RNA-seq-re is. https://github.com/pinin4fjords/shinyngs
Davis McCarthy: Using single-cell RNA-seq data for inference on gene regulation
Az egy sejtes RNA-seq népszerű, mert egyszerű dimenzió redukciós módszerekkel a sejt differenciálódás nyomon követhető. Az expresszió a differenciált sejteknél alacsonyabb a pszeudó idő skálán. A jó eredményekhez természetesen jó bemeneti adatok is kellenek. A scater csomag segítségével a QC könnyen megállapítható. A normalizálásra még nincs általánosan elfogadott módszer, de az scran elfogadható eredményt ad. A különböző batch effektek eltávolítására még mindig az ismétlésszám növelése a legjobb módszer. A hagyományos RNA-seq módszerek nem alkalmazhatóak.
Hagen Tilgner: Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long read sequencing reveals molecular co-association and conservation of distant splicing events
A transzkriptek száma magas, hosszúságuk eltérő, de legtöbbször 400-700 bázispár hosszúak. lncRNS-eknek több izoformájuk van protein kódoló társaikénál, míg utóbbiak hosszabbak. Hosszú PacBio readekkel akarták azonosítani az egyes izoformákat. Sikerült új izoformákat azonosítaniuk, allélspecifikus variációkat is találtak, sőt egyes esetekben még új exononokat is felfedeztek. A kivágódások száma a polyA véghez közelebb megnő. Azt is észrevették, hogy összefüggés van a promóterek és az alternatív splicing között.
Simon Hardwick: Spliced synthetic genes as internal controls in RNA sequencing experiments
Az RNA-seq szekvenálások minőségéről az úgynevezett spike-in kontrol használata ad felvilágosítást. Ezeket a mintáktól jól el kell tudni különíteni. A szintetikus szekvenciák 78 gént tartalmaznak, 164 izoformát, egytől 36 exonig. A méret eloszlásuk 250 nukleotidtól 7kb-ig terjed. A hozzáadott kontrolok koncentrációja fontos, mert ha túl alacsony, akkor az FPKM és a tényleges koncentráció között nagyon nagy lesz a szórás. (Az előadó szerint 5.17 FPKM alatt a model nem használható.) www.sequin.xyz
Pali Meisted: Fast fusion detection, assembly, and quantification using kallisto
A fúziós géne fontos szerepet töltenek be a rák diagnosztikában. Az alap Kallisto k-merek segítségével azonosítja a transzkripteket és ha inkonzisztenciát talál a referenciával, eldobja azt. Ezért az alap program nem jó fúziós gének keresésére. A módosított program ellenben visszaadja azokat az eredményeket, amelyek nem fednek át ismert transzkriptekkel. A fals pozitívok száma magas, de a futási idő csupán 5 perccel növekedett meg. A fals pozitívok egy része a rossz annotációból ered.
