A többszörös illesztés régen egyszerű volt. Fogtuk a szekvenciákat, bedobtuk a ClustalW-be és illesztettünk. Később jött a Mafft, Muscle és a társai, de a recept nem változott sokat.
A szekvenciák aztán hosszabbodtak és már mindenki genomokat akart illeszteni ezresével. Nem csak az aktuális járvány miatt, hanem egyébként is. A gépek viszont még nem állnak azon a szinten, hogy ezt a régi módszerekkel véghezvigyük, ezért megjelentek az egyszerűsítések és a különféle stratégiák.
Bizony, ami régen rutin feladat volt, manapság művészetté lépett elő, ahogy a DECIPHER dokumentációja is sugallja. Röviden nézzük is át, milyen stratégiák vannak!
Régi iskola
Ezt csináltuk régen, és ezt csináljuk most is, ha egyszerű hipotézisekkel dolgozunk. Veszünk egy gént, régiót, majd illesztünk. Általában olyan gént, ami minden, a kutatásban szereplő élőlényben megvan, mint például a jó öreg 18S alegység. A szekvenciák kollineárisak, közel azonos hosszúságúak, használhatjuk a régi jó dolgokat. Az összes bioinformatikai könyv, cikk, bejegyzés ezzel van tele. Előnye, hogy egyszerű, kicsi a hibázás esélye. Viszont nagyfokú szekvencia homológia esetén teljesen használhatatlan, mert minimális lesz a különbség a vizsgált szekvenciák között. Nem lesz olyan szerencsénk, hogy ezt a módszert kelljen használni.
A ráncfelvarrt
Ez majdnem ugyan az, mint az előző, csak sok homológ szakaszt vesznek, azokat mesterségesen összeragasztja, és egy nagy szekvenciával dolgoznak. Egyesek odaig is elmennek, hogy 1500 gént raknak egymás után. Közelrokon fajoknál növeli a szekvenciák diverzitását, de több gond is van vele. Először is, a gének evolúciós sebessége eltérhet. A végső hasonlóságot a hosszabb gének fogják megszabni, ráadásul a gének illesztésének helyén nagyobb eséllyel lesz gap, amit minden illesztőprogram rosszabbul súlyoz, és a később a fa építésénél a valós evolúciós távolságnál nagyobb távolságot kapunk. Ennek a módszernek semmi biológiai relevanciája nincs, szerintem azért csinálják, mert még mindig vissza tudnak nyúlni a megszokott programjaikhoz. Ezt a módszert lehetőleg soha ne használjuk, nyugodtan vállaljunk be egy összeveszést a főnökünkkel, ha erre akar kényszeríteni.
Vadnak született
A helyzet az, hogy legtöbb esetben nincs teljes genomunk, csak dirib-darab szekvenciáink. Ha van is genom, a kollinearitás nem garantált, nekünk mégis ezzel kell dolgoznunk. A megoldás, hogy több homológ szakaszt veszünk, akár csak az előző módszerben, csak nem ragasztjuk össze őket. Több többszörös illesztést végzünk és több fát készítünk, ha evolúciós kapcsolatokat is látni akarunk. De melyiket illesztést, és azon keresztül melyik fát fogadjuk el végső eredményként? Természetesen az összeset, egy konszenzus fa képében, amit például az Astral nevű program is elkészíthet. Kolinearitás garantált, fragmentált genom esetén is működik, közel rokon fajoknál is lesz elég távolság, mégsem viszünk mesterséges hibát a feldolgozásba. Természetesen ez a mószer a legmacerásabb, de szerencsére akadnak, akik nem riadnak meg tőle.
A kívülálló
Érdekes módon a progressiveMauve az általam ismert egyetlen program, ami elfogad bármilyen genomot, akár draft genomokat is, és tudásához mérten elvégzi az illesztést. Az előbb említettem, hogy több homológ szakaszt kell keresni, de baktériumoknál, ahol a horizontális géntranszfer tovább bonyolítja a helyzetet, néha azzal szembesülünk, hogy a homológ gének nem feltétlenül egy leszármazási egységre jellemzőek.
Ez a program viszont autómatikusan megkeresi a synteny blokkokat, meghatározza azok orientációját, létrehoz egy hierarhikus fát, amit vázként használ a precíz illesztéshez. Ez az úgynevezett "guided tree" meglepően korrekt fát hoz létre. A cikk és dokumentáció szerint nem használható filogenetikai elemzésre, de a kollégáim szerint az eredménye nagyon egybevág a biológiával, legalábbis az eddig vizsgált bakteriális genomok esetén így volt.
A módszer hátránya, hogy régi a kód, nem használja ki a többmagú processzorokat. Másik hátránya, hogy bakteriális genomoknál hosszabb szekvenciák illesztése rengeteg időt vesz igénybe.
