Az ember diploid élőlény, ami azt jelenti, hogy a teljes kromoszóma készletéből kettő van. Egy anyai és egy apai eredetű. Ha csak a legegyszerűbb DNS változásokat, a nukleotid variációkat nézzük, akkor ez azt jelenti, hogy ha megnézzük egy egyén SNP-it, akkor azt jó eséllyel megtalálhatjuk legalább egy szülőben is (feltéve, hogy eltekintünk a szekvenálási hibáktól, spontán mutációktól, nukleotid modifikációktól és még egy csomó olyan dologtól, ami csak azért van, hogy összezavarja az ép ésszel megérthető modelljeinket).
Jogos igény, hogy a vizsgálatok során megtalált mutációkat hozzá tudjuk rendelni vagy az anyai vagy az apai kromoszóma készlethez.
Amennyiben nem használtunk speciális könyvtár előkészítési módszereket, úgy bioinformatikai eszközökkel kell megbírkózni a problémával. Ahogy azt már megszokhattuk, itt jönnek a gondok.
Amikor ugyanis egy biológus haplotípusról beszél, akkor az alatt a klasszikus anyai és apai kromoszóma felosztást érti. Ez pedig alapesetben csak és kizárólag bioinformatikai eszközökkel megállapíthatatlan.
Amit egy bioinformatikus meg tud csinálni, az a variációk haplotípus csoportokba rendezése. Mit jelent ez? Azt nem tudom megmondani, hogy apai vagy anyai eredetű-e egy mutáció, de azt mondhatom, hogy az adott mutáció az előtte-mögötte lévő mutációk közül mennyivel van azonos kromoszómán. Ha pedig véget ér egy haplotípus csoport, és kezdődik egy másik, akkor azt célszerű teljesen független egységnek kezelni.
A VCF fájlban, ha egy mutációról egy program meg tudta állapítani, hogy egy adott haplotípus csoportban van, akkor egy "pipe" jellel választja el a genotípust a perjel helyett. Ezt a VCF fájl 10. oszlopától kezdődően láthatjuk, attól függően, hogy mennyi mintát tartalmaz a fájl.
Miként határozható meg, hogy két mutáció egy haplotípus csoportban van-e? A legegyszerűbb módszer, amit akár mi magunk is elvégezhetünk egy IGV segítségével, ha megnézzük, hogy a két mutáció egy readen van-e. Ez a módszer természetesen csak akkor működik, ha a mutációk távolsága kisebb, mint a read hossza, és a mutációk heterozigóták. (Hiszen a homozigóta mutációk mindkét kromoszómán megvannak.) Ha azt látjuk, hogy az egyik mutáció csak a readek felében fordul elő, míg a másik mutáció a readek másik felében fordul elő, akkor különböző kromoszómán vannak. Ha konzekvensen ugyan azon a readen vannak, akkor egy kromoszómán vannak.
Ennek a módszernek a kiterjesztése, ha egy de-novo összeszerelést végzünk, amivel szinte meghosszabbítjuk a readjeinket. Ezt csinálja a GATK HaplotypeCaller modulja.
A módszer a hosszú readek korában reneszánszát éli. A humán X kromoszóma teljes összeszerelése közben azt vették észre a kutatók, hogy a mostani technológiával mindig találni annyi heterozigóta SNP, indelt vagy struktúrális variációt, hogy akár még a centromereken is átívelő haplotípus csoportokat tudtak felépíteni.
A másik módszer, hogy megszekvenáljuk a szülőket. Ezt csinálja például a Beagle program is, de csak a 3-as verziója. Mivel a variációk nagy részét örököljük, nem nehéz megmondani, hogy mi az eredetük. A problémát itt a spontán mutációk okozzák, amelyek nem találhatóak meg egyik szülőben sem.
További lehetőség, amennyiben rendelkezünk genetikai térképpel, hogy meghatározzuk, milyen messze vagyunk a rekombinációs pontoktól. Minél közelebb vagyunk, annál nagyobb az esélye, hogy a haplotípus csoportunk széléhez tartunk.
Mielőtt tovább mennénk, vizsgáljunk meg még egy lehetőséget. Amennyiben nincs lehetőségünk a szülők szekvenálására, de van egy nagyobb genotípizált populációnk (modell organizmusok előnyben, ugyebár) akkor annak segítségével is megállapítható, hogy hol van nagyobb eséllyel rekombináció. Ez a lehetőség a Beagle 4-es verziójától felfelé érhető el. (Miközben az öröklésen alapuló módszert szépen kivették a program funkciói közül.)
Ami a fenti módszerekben közös, hogy végül egy rejtett Markov lánc segítségével próbálják meg meghatározni a haplotípus csoportok határait. Ezt csinálja a HaplotypeCaller, a Beagle a régi és az új verzióiban egyaránt. Itt emlékezzünk vissza, mit is tapasztaltunk, amikor játszottunk a saját rejtett Markov láncunkkal. Nevezetesen, hogy az állapot változások kezdete és vége nem mindig esik egybe a tényleges rejtett állapotok átmeneteivel.
Ezt akkor vettem észre, amikor egy trio adat elemzése közben fázisolni akartam. Lefuttattam a Beagle 3-t, Beagle 5-öt, miközben a VCF a HaplotypeCallerrel készült. A három eredmény elég eltérő volt ahhoz, hogy elkezdjek a dolgok mélyére ásni. Arról nem is beszélve, hogy a rejtett Markov láncok sztochasztikus modellek, tehát az eredmény futásról futásra változhat. Ezért gondolom, hogy a haplotípus meghatározás egy átverés. Hiszen nem azt mondja meg, amit egy biológus elvár, és azt is rosszul. Nem annyira rosszul, mint egy exom alapú CNV, de elég rosszul, hogy az eredményeket kételkedve fogadjam.
A helyzet a hosszú read szekvenálásokkal javulni fog, sőt, most is vannak olyan könyvtár előkészítési eljárások (például a 10x Chromium), amelyek segítségével pontosabban határozhatjuk meg a haplotípusokat. Ha mégis olcsóbban akarjuk megúszni, akkor a referencia panel alapú megoldást válasszuk, mert jelenleg az a legpontosabb. Ha olyan fajjal dolgozunk, ahol nincs referencia panel, akkor próbáljuk megszekvenálni a szülőket is, de ha ez sem megoldható, akkor ne számítsunk semmi jóra.
