Elérkeztünk az RNA-seq legvitatottabb lépéséhez, az illesztéshez. Bárkivel beszéltem eddig RNA-seq-ről, mindenkinek megvolt a jól bejáratott véleménye arról, hogy melyik szoftvert kell használni és ebben a kérdésben nem ismert irgalmat. De én elárulom a nagy titkot. Csak nektek, ingyen. De aztán ne adjátok tovább, mert még mások is tudni fogják:
Tök mindegy. Először is, hiába használunk egy rendkívül kifinomult illesztőprogramot, ami a readek 100%-t illeszti, ha utána a kvantifikálás során a felét eldobjuk. Hiába akarunk egy elképesztően gyors alkalmazást futtatni, ha nincs elég memóriánk. Végezetül a legfontosabb indok: ha két gén expressziója jelentősen eltér, meg fogjuk találni azt, bármilyen programot is használunk.
Természetesen az illesztőprogramok között van különbség, nézzük meg, mik ezek. Még egy fontos dolgot meg kell említeni, ez pedig a felhasznált referencia típusa. Illeszthetünk transzkriptómra vagy genomra. Ha transzkriptómra illesztünk, nem kell foglalkoznunk azokkal a readekkel, melyek átérik az intronokat, tehát a DNS illesztésnél megismert programokat nyugodtan használhatjuk, például a BWA-t. Amire ügyelni kell, hogy a transzkriptóm egy gén több splice variánsát tartalmazhatja, ezért a paramétereket úgy válasszuk meg, hogy korrekt módon kezeljük a több helyre illeszkedő readeket. Erre most nem térek ki.
Ha genomra illesztünk, a többszörösen illeszkedő readek kevesebb gondot jelentenek (paralóg és pszeudó géneket leszámítva), cserébe meg kell küzdeni az intronokon átnyúló readek problémájával.
Bowtie
Ez a program elég egyszerű, még az indeleket sem kezeli. Pont ezért szeretik a mikroRNS elemzéseknél, ahol 20-24 nukleotid hosszú szekvenciákat kell a genomra pakolni, de azt gyorsan. Hátránya, hogy nagyon nagy genomokat nem képes kezelni. Embernél még nincs gond, de a búza genom gondot okoz neki.
TopHat
Kicsit öregecske program, már eljárt felette az idő. Lassú is szegény. Csak a történelmi hűség kedvéért említem meg. Annak idején a Tuxedo pipeline része volt, de a STAR megjelenésével sokan lecserélték. Ha az illesztésen kívül fúziós fehérjéket is akarunk keresni, a TopHat fusion a mi eszközünk.
GSNAP
Az EBI-ban az egy sejtes csoportok kedvenc illesztője. Változatos módon paraméterezhető. Sebességben a STAR mögött végez, de kicsivel több readet illeszt annál. Saját futtatásaim alapján viszont úgy láttam, hogy a génekre illeszkedő readek száma alacsonyabb, valamint több olyan readet is illeszt, ami három exonon is átnyúlik. Pontos számokat nem tudok mondani és az is elképzelhető, hogy paraméter tuningolással a fals illesztések száma is csökkenthető. Összességében teljesen korrekt program, memória szükséglete a STAR töredéke. Soha ne futtassuk alapértelmezett beállításokkal, mert használhatatlan eredményt produkál. A readeket annyi módon illeszti, ahány módon csak tudja, ami a sebességére is hátrányosan hat. Az EBI-os srácok a következő paraméterekre esküsznek:
gsnapl -t 4 -A sam -B 5 -n 1 -Q -N 1 -D referencia_dir -d referencia_nev read1.fastq read2.fastq
STAR
Ez az illesztő igazán univerzális. Hihetetlenül gyors, viszont a memória éhsége óriási, ami többszálú alkalmazásnál tovább növekszik. A Sangerben ez az RNA-seq pipeline része. A fejlesztője olyan opciókat is adott a programhoz, hogy a TopHathez hasonló kimenetet produkál, ezért egy TopHat alapú rendszerben fájdalommentesen beilleszthető. Rá épül egy fúziós fehérje kereső algoritmus, a STAR-Fusion. Ha van elég memóriánk érdemes ezt használni. Fontos, hogy alapértelmezett módon futtatva a nem illeszkedő readeket eldobja, ami a minőségi mutatók meghatározásánál gondot okozhat. Egy igazán sokoldalú paraméterezés a következő:
STAR --runThreadN 12 --outSAMstrandField intronMotif --outFileNamePrefix sample --outSAMattributes NH HI NM MD AS XS --twopassMode Basic --outSAMunmapped Within --chimSegmentMin 12 --chimJunctionOverhangMin 12 --alignSJDBoverhangMin 10 --alignMatesGapMax 200000 --alignIntronMax 200000 --chimSegmentReadGapMax parameter 3 --alignSJstitchMismatchNmax 5 -1 5 5 --limitBAMsortRAM 31532137230 --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --readFilesCommand zcat --genomeDir reference --readFilesIn reads1.fastq.gz reads2.fastq.gz
Ezek a paraméterek STAR-Fusion és TopHat kompatibilisek.
HISat
Az új trónkövetelő. Erőforrás igénye alacsony, sebessége elképesztő. Rá épül az új Tuxedo pipeline, ami azért hagy még némi kívánni valót maga után. A program képes közvetlenül használni az SRA-t. Nem kell azokat Fastq-vá konvertálni.
