Réges-régen az elérhető nukleotid szekvenciákat csak az NCBI-ról töltöttem le. Ez egyszerű volt és működött. Egy adatbázis rekord egyetlen szekvenciát foglalt magába. Ahogy szaporodtak a tárolandó adatok, úgy kezdett egyre összetettebb lenni a rendszer.
A genom szekvenálásokkal mindez megváltozott. Mint arról már többször írtam, a genom összeszerelés gyakran fragmentált szekvenciákat eredményez, amelyeket nem könnyű a fent vázolt rendszerben tárolni. Megjelentek a mester rekordok, amelyeknek semmi más szerepe nincs, mint összefogni a sok száz dirib-darab szekvenciát. Tényleges szekvenciák nincsenek benne, helyette jó sok link más rekordokra. A problémáim itt kezdődtek.
Egy kézirat beadásánál az egyik bíráló azt kérte, hogy nézzük meg, az ismeretlen törzsünk hol helyezkedik el a baktériumok világában. Egészen pontosan melyik szerotípusba tartozik. Ehhez nem kellett mást tenni, mint leszedni rengeteg genomot, kiszedni belőlük egy gént, majd többszörös illesztést futtatni.
Már írtam egy szkriptet, ami az NCBI E-utilja segítségével leszedi a szekvenciákat, hogy ne kelljen egyesével bogarászni. A 94 szekvenciából a program le is szedett 20-t. Elkezdtem manuálisan letölteni a maradékot. Ehhez az azonosítókat beírtam az NCBI főoldalára, ahol az összes adatbázisban egyszerre lehet keresni.
Az eredmény oldalon felsorolják az összes adatbázist, és azt is, hogy mennyi találat volt bennük. Néhány esetben viszont kaptam közvetlen linket a FASTA fájlra is. Ennek nagyon megörültem, rögtön kattintottam, és már töltöttem is a szekvenciát.
Néhány esetben viszont csak egy link jött fel az összeszerelt mester rekordra, FASTA link sehol nem volt. Ez sem nagy gond, a második oldalon ott is letölthettem a szekvenciákat. Sok esetben pedig csak a BioProject-re kaptam linket. A BioProjektből eljutottam a mester rekordig, onnan az összeszereléshez, majd a FASTA-hoz.
Bárhogy gondolkodtam, nem sikerült megértenem, hogy milyen logika alapján kapok egyszer közvetlen FASTA linket, egyszer összeszerelést, másszor BioProjektet. De megszereztem minden szekvenciát, ami kellett, ezért nem is erőltettem a dolgot. Jöhetett a következő lépés.
Mivel sok esetben csak draft genom volt, annotáció nélkül, ezért a jó öreg Blast program segítségével kerestem meg az rpoB gént, ami alapján a többszörös illesztést el akartam végezni. Ez a gén azért jó választás, mert az RNS polimeráz egyik alegységét kódolja, vagyis a DNS másoláshoz elengedhetetlen. Nélküle a sejt nem tud osztódni.
A keresésnél viszont kiderült, hogy a genomokból néha hiányzik az rpoB gén, ami lehetetlen, hacsak nem a szekvenálás során valahogy kimaradt. Ennek viszont ellentmondott, hogy ezeket a törzseket egy másik csoport pont az rpoB gén segítségével már elemezte. Ezért is mertük kiválasztani őket a saját vizsgálatunkhoz.
Futtattam egy webes Blastot az említett génnel, és a keresett törzs feljött, mint találat. Vagyis a biológia működik. Törzs ugyan az volt, de a szekvencia azonosító teljesen más! Ha az azonosítóhóz tartozó szekvenciát megnéztem, kiderült, hogy a törzs egy másik kontigját találtam meg. Ja, hogy ebből több is van!
Nézzünk egy konkrét pédát. Ha a főoldalon rákeresek a APOO01000000-ra, akkor kapok egy 17 ezer nukleotidos kontigot. De maga a szekvencia 26 scaffoldból áll. Akkor miért ezt a kontigot kapom eredményül? Ha ugyan ezt az azonosítót a nukleotid keresőbe írom be, akkor helyesen a mester rekordot kapom, ahonnan kiválaszthatom, mit szeretnék letölteni. Nézzünk egy másik esetet. Ha a APOH01000000 rekordot írom be a főoldalra, akkor minden rendben működik, mert a rendszer a BioProjektet vagy az összeszerelést adja fel opciónak, nem választ ki egy random kontigot.
Pedig még nem is érintettünk minden problémát! A helyzetet tovább bonyolítja, hogy egyes rekordok eltűntek, illetve átalakultak. Az eredeti cikkben, ami alapján le akartuk tölteni a genomokat, szerepelt egy azonosító: NZ_MAUF00000000. A főoldalon sunyi módon nem jelölnek semmit. A nukleotid keresőben legalább kapunk egy üzenetet, hogy kitörölték. De azt senki nem mondja, mi van helyette. Össze-vissza ugrálva az oldalak között az ember végül ráakad erre: CP029397.2, ahol mellékesen felsorolják a régi azonosítókat is, hogy fellélegezhessünk: megvan, amit kerestünk.
Az első két bemutatott azonosító, 4 betű és nyolc szám kombinációt tartalmazott. Az utolsóban az NZ_ előtag micsoda? Erre még nem jöttem rá. Néhány esetben nincs is rá szükség: NZ_CP029397 és CP029397 ugyan azt hozza fel. (Jó, nem teljesen ugyan az, mert a második esetben megpróbálja a teljes rekordot letölteni, de akkor is, ez nem különbség.)
Feltételezem, a két kereső két különböző adatbázisból dolgozik, amelyek között van némi inkonzisztencia. Az azonosítók variálása pedig további galibákat okozott. Mi van, NCBI? Döglődünk, döglődünk?
